Rhona Mitra lahir di Paddington, London, Inggris, dari pasangan Nora Downey dan Anthony Mitra, seorang ahli bedah kosmetik. Ia memiliki seorang kakak dan adik. Orang tuanya berasal dari latar belakang Bengali-India, Inggris, dan Irlandia. Pada usia 8 tahun, orang tuanya bercerai dan dia dikirim ke sekolah asrama. Ia menghabiskan beberapa tahun di dua sekolah berbeda, termasuk Roedean, namun mengklaim pernah dikeluarkan dari keduanya.

Pertama kali dikenal lewat peran sebagai kekasih terlarang Scott Wolf di serial Party of Five (1994), Rhona kemudian tampil di film Hollow Man (2000) sebagai korban pemerkosaan Kevin Bacon. Ia juga membintangi drama medis Gideon's Crossing (2000) sebagai Dr. Alejandra Ollie Klein.

Selanjutnya, Mitra membintangi berbagai film seperti Ali G Indahouse (2002), Sweet Home Alabama (2002), Stuck on You (2003), serta peran utama di Highwaymen (2004) dan Spartacus (2004). Ia juga tampil di serial The Practice dan Boston Legal, serta di serial Nip/Tuck sebagai Kit McGraw (2005). Pada tahun 2008, ia memerankan Major Eden Sinclair di film Doomsday.

Pada 2009, Rhona membintangi Underworld: Rise of the Lycans sebagai Sonja, karakter putri vampir. Ia juga menjadi model live-action untuk karakter Lara Croft di seri video game Tomb Raider. Pada 2001, ia menempati peringkat #46 di Maxim Hot 100 Women.