Natalie Portman lahir dengan nama Natalie Hershlag pada 9 Juni 1981 di Jerusalem, Israel. Ia adalah anak tunggal dari Avner Hershlag, dokter asal Israel, dan Shelley Stevens, seniman dan agen Natalie yang lahir di Cincinnati, Ohio. Kedua orangtuanya berketurunan Yahudi Ashkenazi. Keluarganya meninggalkan Israel dan pindah ke Washington, D.C., saat Natalie masih sangat muda.

Setelah beberapa kali pindah, keluarga akhirnya menetap di New York, tempat Natalie tinggal hingga saat ini. Ia lulus dengan predikat honors dari sekolahnya dan diterima di Harvard University berkat prestasinya. Pada usia 11 tahun, seorang agen penyalur menemukan bakatnya saat ia sedang di sebuah restoran pizza. Awalnya diarahkan ke dunia model, tetapi Natalie lebih memilih berkarir di dunia akting.

Debut filmnya terjadi melalui film Léon (1994), yang membuka jalan bagi peran-peran berikutnya di film seperti Heat (1995), Beautiful Girls (1996), dan Mars Attacks! (1996). Kepopuleran global diraihnya saat membintangi Star Wars: Episode I - The Phantom Menace (1999) sebagai Queen Padmé Amidala, yang meraih pemasukan sebesar US$431 juta.

Setelah itu, ia membintangi film seperti Anywhere But Here (1999), Where the Heart Is (2000), dan Closer (2004), yang membuatnya mendapat nominasi Oscar. Ia kembali memerankan Padmé dalam dua episode lanjutan Star Wars, yaitu Attack of the Clones (2002) dan Revenge of the Sith (2005). Pada 2010, Natalie meraih Oscar dan Golden Globe sebagai Aktris Terbaik lewat film Black Swan. Ia juga mendapat nominasi kedua sebagai Aktris Terbaik dalam film Jackie (2016).