Justin Long lahir dan dibesarkan di Fairfield, Connecticut, sebagai anak kedua dari tiga bersaudara. Ayahnya adalah seorang profesor filsafat dan ibunya mantan aktris Broadway. Ia keturunan Jerman, Sisilia, dan Polandia, menunjukkan latar belakang multikultural. Setelah menyelesaikan pendidikan di Fairfield Prep dan Vassar College, Justin menunjukkan bakat komedi melalui kelompok "LaughingStock" dan mulai mendapatkan perhatian di dunia hiburan.

Peran pertamanya yang menonjol adalah sebagai Warren Cheswick dalam serial TV Ed (2000), yang menarik perhatian dan membuka peluang di dunia perfilman. Ia juga membintangi Galaxy Quest (1999), serta film horor Jeepers Creepers (2001) yang sukses di kalangan penggemar genre tersebut.

Selain itu, Justin membintangi film seperti Crossroads (2002) bersama Britney Spears dan mendapatkan popularitas lewat film komedi Dodgeball (2004). Ia juga bermain dalam berbagai film independen seperti Raising Genius dan Waiting..., serta film komersial Herbie: Fully Loaded (2005) dan Live Free or Die Hard (2007). Ia terus mendapatkan pengakuan dari kritikus dan penggemar.

Kariernya juga meningkat melalui penampilan dalam film romantis The Break-Up (2006) dan menjadi wajah sebagai juru bicara produk Apple Mac. Ia dikenal pribadi yang tertutup dan tidak sering hadir di acara sosial, meski hubungannya dengan aktris Drew Barrymore sempat menjadi sorotan di 2008.