John Alberto Leguizamo Peláez lahir pada 22 Juli 1960 di Bogotá, Kolombia, dari orang tua Luz Marina Peláez dan Alberto Rudolfo Leguizamo. Sejak kecil, keluarganya bermigrasi ke Amerika Serikat dan dia dibesarkan di Queens, New York. Ia berkuliah di New York University dan sempat belajar di bawah pelatih teater terkenal Lee Strasberg sebelum Strasberg meninggal dunia. Leguizamo mulai berkecimpung di dunia komedi dan tampil di klub-klub komedi di New York.

Penampilan pertamanya di layar adalah di serial Miami Vice (1984), diikuti peran kecil di film Casualties of War (1989) dan Die Hard 2 (1990). Puncak kariernya terjadi selepas membintangi film independen Hangin' with the Homeboys (1991), yang membawanya dikenal karena peran sebagai remaja dari Bronx yang canggung. Tahun 1991 juga menandai debut panggungnya dengan pertunjukan John Leguizamo: Mambo Mouth, yang meraih banyak penghargaan dan diadaptasi ke HBO.

Setelah itu, ia terus berkarya baik di panggung maupun layar. Pada tahun 1993 dan 1995, dia meluncurkan pertunjukan satir tentang stereotip Latino, Spic-O-Rama. Ia juga menciptakan dan membintangi serial komedi House of Buggin' tahun 1995, yang mendapat nominasi Emmy. Film-film terkenalnya meliputi Super Mario Bros., Romeo + Juliet, Spawn dan debut Broadway Freak tahun 1998. Ia dikenal karena suaranya yang unik dan kemampuan beragam dalam akting, pengisian suara, hingga menyutradarai.

Leguizamo juga terkenal karena peran dalam film besar seperti Moulin Rouge!, Ice Age, dan Collateral Damage. Ia dianggap sebagai pelopor yang membuka jalan bagi aktor Latino di Hollywood, sambil tetap bangga akan identitas dan warisan budayanya. Karyanya telah memperluas representasi Latino di industri film dan panggung dunia.