John Yohan Cho lahir di Seoul, Korea Selatan, dan pindah ke Los Angeles, California saat kecil. Ayahnya seorang pendeta Kristen dan keluarganya menanamkan nilai agama dan budaya Asia ke dalam kehidupannya. Selama di sekolah, ia menempuh pendidikan di Herbert Hoover High School di Glendale dan kemudian belajar sastra Inggris di University of California, Berkeley. Setelah lulus, ia kembali ke Los Angeles dan mulai mengajar di Pacific Hills School sebagai guru Bahasa Inggris kelas 7, sebelum akhirnya memulai karier di dunia akting.

Awalnya, Cho tampil dalam peran kecil di film seperti Wag the Dog (1997), Bowfinger (1999), dan Better Luck Tomorrow (2002). Terobosan besar datang saat ia tampil di film komedi remaja American Pie (1999), di mana ia membantu menciptakan frase 'MILF'. Ia juga membintangi film Harold (2004) yang sukses dan kemudian dikenal luas melalui perannya sebagai Hikaru Sulu dalam reboot franchise Star Trek (2009), yang menandai titik balik kariernya.

Sambil aktif di dunia akting, Cho juga menyanyi dan menjadi anggota band Viva La Union. Ia terus bekerja di Hollywood, tampil dalam film independen Columbus (2017), thriller Searching (2018), dan film horor The Grudge (2019). Kehidupannya dirajut dengan kebahagiaan berkeluarga, menikahi aktris Kerri Higuchi dan memiliki dua anak. Ia dikenal sebagai aktor berbakat dan multi-talenta yang terus berkembang di industri hiburan.