Lahir dan besar di New York City, Glenne Headly sejak kecil sudah menunjukkan minat besar terhadap dunia akting. Setelah lulus dari High School of Performing Arts dengan predikat honors, dia memilih studi di Eropa di bidang sejarah seni dan sastra, karena sadar bahwa karier akting akan menyita sebagian besar hidupnya.

Setelah kembali ke New York, Glenne terinspirasi untuk bergabung dengan komunitas teater di Chicago. Di sana, dia tampil dalam pementasan Curse of The Starving Class, yang mempertemukannya dengan Steppenwolf Theatre Company. Ia pun menjadi anggota troupe dan memenangkan empat penghargaan Joseph Jefferson untuk kategori aktris pendukung terbaik.

Karier panggungnya terus berkembang, termasuk penghargaan Theatre World Award dan penampilan di berbagai produksi Broadway seperti Arms & the Man bersama Kevin Kline dan Raul Julia. Ia juga tampil di film seperti Nadine dan Making Mr. Right, serta mendapatkan nominasi Emmy pertama lewat serial Lonesome Dove.

Peran terobosannya di film adalah dalam Dirty Rotten Scoundrels (1988), yang memperlihatkan kemampuan aktingnya sebagai 'victim' yang cerdik. Ia kemudian berperan sebagai Tess Trueheart di Dick Tracy (1990), dan membintangi film lain seperti Mr. Holland's Opus, Mortal Thoughts, serta film-film akhir hayatnya.

Di dunia televisi, Glenne pernah tampil di serial populer seperti ER dan Monk, serta di sitkom Encore! Encore!. Ia juga berperan dalam pementasan teater On Golden Pond dan telefilm seperti Women vs. Men dan Bastard Out of Carolina, yang memberinya nominasi Emmy kedua.

Beberapa karya terakhirnya termasuk The Moguls, The Namesake, dan The Joneses. Selama 14 tahun, ia menempatkan keluarga di atas segalanya, menjadi ibu yang hadir dan menyempatkan diri untuk mendidik anaknya secara homeschooling selama satu tahun saat kebutuhan sekolahnya.