Benicio Del Toro lahir pada 19 Februari 1967 di Santurce, Puerto Rico, dari orang tua pengacara, Fausta Genoveva Sanchez Rivera dan Gustavo Adolfo Del Toro Bermudez. Setelah ibunya meninggal saat ia masih muda, keluarganya pindah ke peternakan di Pennsylvania.

Ia awalnya tertarik pada bidang basket dan studi bisnis di University of California, San Diego. Namun, sebuah kelas akting membangkitkan minatnya terhadap dunia akting, sehingga ia memutuskan berhenti dari kuliah dan belajar dengan terkenal Stella Adler di Los Angeles serta di Circle in the Square di New York.

Di akhir 1980-an, ia tampil di televisi, termasuk Miami Vice dan miniseries Drug Wars. Karir filmnya dimulai dengan peran kecil di Big Top Pee-wee (1988) dan kemudian sebagai penjahat Dario di James Bond: Licence to Kill (1989), menjadikannya aktor termuda yang memerankan villain Bond pada usia 21 tahun.

Selama tahun 1990-an, ia tampil dalam banyak film yang kurang dikenal sebelum mendapat perhatian besar pada 1995 lewat perannya di The Usual Suspects, yang memenangkan Oscar dan ia meraih Independent Spirit Award. Ia dikenal sebagai aktor yang setia pada karya independen, tampil menonjol sebagai gangster di The Funeral dan Basquiat.

Peran utama pertamanya di film Hollywood terjadi di Excess Baggage (1997). Kemudian, ia membintangi Fear and Loathing in Las Vegas (1998) bersama Johnny Depp, di mana ia menunjukkan kemampuan akting metode yang luar biasa, meski menuai kritik keras. Tahun 2000 menjadi titik balik besar saat ia membintangi Traffic dan Snatch, yang semakin mempopulerkannya.

Kariernya terus berkembang, dan ia dikenal sebagai aktor yang teliti memilih proyek serta bekerja sama dengan sutradara ternama. Berkat peran di Traffic, ia mendapatkan penghargaan dari Screen Actor’s Guild dan terkenal sebagai salah satu aktor paling dihormati dan karismatik di industri film internasional.