Andy Samberg lahir di Berkeley, California, dari pasangan Marjorie (seorang guru) dan Joe Samberg (seorang fotografer). Bersama Jorma Taccone dan Akiva Schaffer, ia membentuk The Lonely Island, trio penulis dan pelaku seni yang dikenal lewat video komedi singkat yang tayang di jaringan TV dan situs online. Mereka terkenal lewat parody seperti The 'Bu dan pilot Awesometown.

Karier Andy meningkat saat bertemu Jimmy Fallon saat menulis untuk MTV Video Music Awards 2004. Fallon menyarankan mereka untuk audition di Saturday Night Live, dan akhirnya Andy menjadi pemeran tamu dan anggota The Lonely Island menjadi penulis. Mereka menghasilkan video populer seperti Lazy Sunday, Dick in a Box, dan I’m on a Boat.

Selama di SNL, Andy mulai membintangi film Hot Rod (2007), sebagai proyek besar pertamanya, didukung oleh Lorne Michaels. Setelah tujuh tahun di SNL, ia keluar pada 2012 dan kemudian bergabung dengan serial Brooklyn Nine-Nine sebagai Jake Peralta, detektif brilian sekaligus ceria dan immature. Peran ini membawanya meraih Golden Globe pada 2013.

Pada 2016, Andy tampil di film mockumentary musik Popstar: Never Stop Never Stopping, yang juga disutradarai dan dibintangi Jorma dan Akiva. Ia menikah dengan penyanyi Joanna Newsom pada tahun 2013 di Big Sur, California, dan mereka dikaruniai putri pada 2017.